Лекция 2. Основни типове ин витро култури – класификация, основни
характеристики (особености в сравнение с ин виво култивирането) и изисквания
•
Тотипотентност-свойството на соматичните растителни клетки изцяло да
реализират генетичния потенциал на растението, тоест омнипотентността
на ядрото (запазване генетичната информация на ядрото на зиготата и
отсъствие на забрана за повтора експресия на гените, позволяваща преход в
меристемно състояние с последващи повторно диференциация и
редиференциация) с образуване на цял организъм.
•
Развитието на цяло растение in vitro при наличието на определени условия. зависи
от:
•
¬
Степента на на дезинтеграция – правопропорционално
•
¬
Специализация и диференциация на клетките – обратно пропорционално
•
¬
Влияние на вътрешни и външни фактори (корелативни връзки, активиране на
блокирани гени, условия на култивиране, експланти, цел и др.
Класификации:
Fossard (1977)
1. Организирани - почти цяло растение (ембриокултури, семена) - запазена
структура на растението или органа, методът е аналогичен на
in vivo
вегетативното
размножаване чрез щеклинги или резници.
2. Неорганизирани култури – клетките и тъканите са изолирани от организирана
част на растението, след което се дедиференцират и култивират. За индукция на
неорганизиран растеж се прилагат много високи концентрации ауксини и
цитокинини. Много слаба генетична стабилност, наличие на различия с донорните
растения.
3. Междинен тип – клетките в изолираните органи и тъкани първо се
дедиференцират и след това чрез делене образуват тъкани или слой от калусни
тъкани, от които се формират органи (корени или стъбла, проембрио или ембрио).
Често получените растения не са напълно идентични с изходното донорно растение.
Pierick (1987)
1.Интактни растения – семената се развиват при различни от
ин виво
условия,
запазена цялост, идентични на донорните растения.
2. Ембриокултури – изолирано ембрио се развива при изкуствени условия, отстранени
хранителни тъкани (котиледони, ендосперм, семенна обвивка), различни условия,
запазена цялост, идентични растения на донорните.
3.Органни култури – култивират са изолирани органи (корени, листа, съцветия).
Поддържат се чрез експланти, от които при подходящи условия се развиват растения, не
винаги напълно идентични на донорните.
•
Експлант - част от растението, която се използва за въвеждане в култура.
•
Използване на стъблен експлант за размножаване ин витро
•
Използване на част от луковица като експлант за размножаване ин витро
4. Калусни култури – получаване чрез дедиференциация на диференцирани тъкани в
условия
in vitro
и нарастване чрез неорганизирано и неограничено делене на клетките.
Различия с донорните растения.
- Инициация на калусна култура от листни и други експланти –и при трансформация
5. Клетъчни (суспензиални) култури. Култивиране на единични клетки или агрегати в
течна хранителна среда.
6. Протопластни култури. Култивиране на протопласти, получени чрез разграждане на
клетъчната стена по ензимен път. Различия с донорните растения.
Основни характеристики на
in vitro
културите
1. Нарушена цялост на растителния организъм
- ембриокултури и интактни растения – най-слаба
- клетъчни и протопластни култури – най-силна
2. Нарушаване на нормалните, корелативни връзки между клетки, тъкани и органи.
- основна причина за трудности в култивирането
3. Нарушено действие на надклетъчните системи за регулация.
- хормонална
- трофична
- електрофизиологична
4. Липса на автотрофно хранене.
- пълна хетеротрофия (клетъчни и протопластни култури)
- миксотрофно (органни култури)
5. Нарушени системи за транспорт (флоем-ксилем) – правопропорционално на степента
на дезинтеграция.
- липса на корен ( аминокиселини, органични в-ва, цитокинини, специфичен орган
за минералното хранене и водния режим)
6. Различен воден режим. Различни условия за приемане на вода и минерални вещества.
- в течни среди – облекчено
- в твърди среди висок осмотичен потенциал, затруднено
- много слаба транспирация
- висока влажност в култивационните съдове
- нарушена дейност на устичния апарат
7. Процеси на де- и редиференциация, рядко срещащи се ин виво (тумурни
образования, вторично образуване на корени)
8. Различни условия на култивиране ин витро в сравнение с ин виво:
- стерилност (съдове, среди, експланти), отсъствие на коренова микрофлора,
епифитна микрофлора, органи за синтез на хормони и др.вещества.
- култивиране върху изкуствени хранителни среди
- различен температурен режим, липса на различия в денонощието, сезоните,
различна температура на кореновата с-ма, витрификация
- постоянен по интензивност, но различен по качество от слънчевата светлина
светлинен режим, липсва ритмика, постоянен фотопериод
- различен състав на атмосферата в съдовете (високо количество въглероден
диоксид и етилен, ниско на кислород, висока влажност)
Основни изисквания при ин витро култивиране
1. Абсолютна стерилност при всички етапи на работа.
- добре изградена и оборудвана лаборатория – пространствено изолиране на
лабораториите за приготвяне и автоклавиране на хранителната среда, ламинарите с
други помещения и др.
- добре обучени специалисти
¬
Стерилизация на въздуха
- ламинар-боксове, UV бактерицидни лампи (предпазни мерки)
¬
Стерилизация на хранителната среда:
- чрез физично разрушаване на микроорганизмите (бактерицидни лампи, йонизираща
радиация, горещ агар)
- химично (антибиотици)
- механично ( бактерицидни филтри)
- автоклавиране ( времето в зависимост от количеството на средата в култивационните
съдове, температура 120-150оС, налягане 0.8-1.0 атмосфери)
- добър биологичен индикатор за време и температура на автоклавиране е вид Бацилус,
който загива за 15-20 мин при 121оС